達(dá)立通顆粒整體質(zhì)量研究進(jìn)展（十七）
發(fā)布時(shí)間：2024-05-26 18:34:07 | 來(lái)源：【藥物研發(fā)團(tuán)隊(duì) 2024-5-26】
依據(jù)《中藥復(fù)方制劑整體質(zhì)量評(píng)價(jià)體系的構(gòu)建及應(yīng)用》中關(guān)于構(gòu)建中藥復(fù)方制劑整體質(zhì)量評(píng)價(jià)體系的技術(shù)路線，按照《達(dá)立通顆粒整體質(zhì)量研究方案》，開(kāi)展達(dá)立通顆粒整體質(zhì)量評(píng)價(jià)研究，包括研發(fā)立項(xiàng)研究、組方和方解研究、中藥材/飲片質(zhì)量研究、生產(chǎn)過(guò)程控制技術(shù)研究、作用機(jī)制研究、質(zhì)量標(biāo)志物和生物標(biāo)志物研究、循證醫(yī)學(xué)研究、藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)研究。根據(jù)項(xiàng)目進(jìn)展情況，我們將陸續(xù)報(bào)道相關(guān)研究成果。
本期主要探討達(dá)立通顆粒治療功能性便秘的作用。
功能性消化不良（FD）是指位于上腹部的一個(gè)或一組癥狀，主要包括上腹部疼痛、上腹部燒灼感、餐后飽脹和早飽感、惡心、嘔吐、噯氣等慢性消化不良癥狀，但其臨床表現(xiàn)不能用器質(zhì)性、系統(tǒng)性或代謝性疾病等來(lái)解釋的胃腸疾病，其發(fā)病機(jī)制與內(nèi)臟高敏反應(yīng)、精神情志、胃腸動(dòng)力改變、胃排空延遲、十二指腸屏障功能障礙、胃腸道分泌功能改變、膽汁酸吸收不良、腸道微生物失調(diào)和腸腦軸改變、遺傳因素等相關(guān)。
功能性便秘（FD）是一種以排便困難、排便次數(shù)減少或排便不盡為主要表現(xiàn)，且不符合便秘型腸易激綜合征（IBS-C）的功能性腸病（FBDs），屬于胃腸動(dòng)力障礙性疾病，其發(fā)病機(jī)制主要與生活方式、飲食、精神情志、胃腸動(dòng)力改變、胃排空延遲、結(jié)腸傳輸功能障礙、盆底肌群運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)、腸道敏感性異常、腸道微生物失調(diào)、腸腦軸改變、腸神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙、神經(jīng)遞質(zhì)改變、遺傳因素等相關(guān)。功能性消化不良患者常伴有功能性便秘，極大地影響患者的正常工作和生活。
侯葉廷等通過(guò)對(duì)63例功能性消化不良患者、34例功能性便秘患者、46例功能性消化不良伴功能性便秘患者以及40例無(wú)消化道癥狀的健康體檢者的研究發(fā)現(xiàn)，功能性消化不良患者和功能性便秘患者都存在胃排空延遲，即都存在胃腸動(dòng)力異常，功能性胃腸病可能存在共同的發(fā)病機(jī)制，相同的病理生理可存在于胃腸道的多個(gè)部位，其中胃腸動(dòng)力異常就是其中可能的共同機(jī)制之一；另一方面，胃腸道不同部位具有類似的發(fā)病機(jī)制，如內(nèi)臟高敏反應(yīng)、傳輸減慢等，則應(yīng)針對(duì)共同的病理生理機(jī)制進(jìn)行干預(yù)。對(duì)于功能性消化不良、功能性便秘、功能性消化不良伴功能性便秘患者給予促胃腸動(dòng)力藥物治療，可以很大程度緩解便秘及上腹部癥狀，為達(dá)立通顆粒治療功能性消化不良、功能性便秘、功能性消化不良伴功能性便秘提供了臨床試驗(yàn)依據(jù)。
達(dá)立通顆粒是促胃腸動(dòng)力中藥，用于治療動(dòng)力障礙型功能性消化不良所致的胃脘脹滿、噯氣、納差、胃中灼熱、嘈雜泛酸、脘腹疼痛、口干口苦等。蘇艷等研究結(jié)果表明，達(dá)立通顆粒能顯著促進(jìn)功能性消化不良模型大鼠、斑馬魚(yú)的胃腸運(yùn)動(dòng)和胃排空，顯著改善模型動(dòng)物消化不良癥狀；橙皮苷等黃酮類化合物是達(dá)立通顆粒促進(jìn)胃腸動(dòng)力和胃排空治療動(dòng)力障礙型功能性消化不良的主要藥效成分。 占煜等研究結(jié)果表明，橙皮苷可通過(guò)上調(diào)結(jié)腸ANO1、c-kit、PDGFRα、P2Y1、SK3表達(dá)水平，恢復(fù)Cajal間質(zhì)細(xì)胞和PDGFRα+細(xì)胞的表型及功能，改善SIP合胞體功能及結(jié)腸動(dòng)力，從而干預(yù)便秘大鼠，為達(dá)立通顆粒治療功能性消化不良、功能性便秘、功能性消化不良伴功能性便秘提供了理論依據(jù)。以下是占煜等關(guān)于橙皮苷改善洛哌丁胺誘導(dǎo)便秘大鼠結(jié)腸SIP合胞體功能的研究報(bào)告。
腸道動(dòng)力本質(zhì)上取決于平滑肌細(xì)胞（SMC）的興奮性。作為胃腸道時(shí)相性收縮即慢波（SW）的起搏點(diǎn)和傳導(dǎo)者Cajal間質(zhì)細(xì)胞（ICC）、血小板衍生因子受體α陽(yáng)性細(xì)胞（PDGFRα+cells）與SMC通過(guò)縫隙連接、電藕合共同構(gòu)成SIP合胞體（SIP syncytium）。據(jù)報(bào)道，SIP合胞體功能與腸道動(dòng)力密切相關(guān)，參與胃腸基本電節(jié)律調(diào)控和神經(jīng)遞質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)。傳統(tǒng)中藥在功能性便秘的治療方面占據(jù)重要地位。通過(guò)相關(guān)文獻(xiàn)的查閱，發(fā)現(xiàn)中藥改善便秘的作用可能與橙皮苷等黃酮類有關(guān)。因此，占煜等研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)展了旨在基于結(jié)腸SIP合胞體功能探討橙皮苷干預(yù)洛哌丁胺誘導(dǎo)的大鼠便秘相關(guān)作用機(jī)制研究。
一、材料與方法
（一）動(dòng)物納入及排除標(biāo)準(zhǔn)
1、納入標(biāo)準(zhǔn)
選用SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，5周齡，體重 125～140 g，進(jìn)食、飲水、排便、活動(dòng)等均正常。
2、排除標(biāo)準(zhǔn)
體重不達(dá)標(biāo)或進(jìn)食、飲水、排便、活動(dòng)等不正常的大鼠。
（二）樣本量計(jì)算方法
本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行各組大鼠間各項(xiàng)指標(biāo)的比較進(jìn)行樣本量估算。
（三）動(dòng)物
本實(shí)驗(yàn)在四川生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院完成，36只5周齡SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，體重125～140g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（川）2018-076，由四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)頒發(fā)，適用范圍為屏障環(huán)境大鼠。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境保持溫度20～26℃，濕度40%～70%，換氣次數(shù)為每小時(shí)15次，空氣潔凈度7級(jí)，12/12h的晝夜節(jié)律。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)川北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核［（2021）106號(hào)］，符合動(dòng)物保護(hù)、動(dòng)物福利和倫理原則，符合國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理的相關(guān)規(guī)定。
（四）藥物
鹽酸洛哌丁胺膠囊（2mg/粒，批號(hào)：LB J8215）由西安楊森制藥有限公司提供。聚乙二醇4000散（10g/袋，批號(hào)：P21731）由馬應(yīng)龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供。橙皮苷（300 mg/盒，批號(hào)：21060909），含量為99.48%，由成都普菲德生物技術(shù)有限公司提供。
（五）主要試劑及儀器
鈣激活氯通道蛋白（ANO1）抗體（美國(guó)Bioss公司，bs-3794R）。酪氨酸受體激酶蛋白（c-kit）抗體（英國(guó)Abcam公司，ab231780）。PDGFRα 抗體（江蘇Affinity公司，AF0241）。P2嘌呤受體1（P2Y1）抗體（江蘇Affinity公司，DF10258）。KCNN3/SK3 通道蛋白（SK3）抗體（江蘇Affinity公司，DF13233）。PDGFRα-蛋白基因產(chǎn)物9.5（PGP9.5）抗體（江蘇 Affinity 公司，DF6854）。水合氯醛（上海Aladdon 公司#C104202）。引物（上海生工生物工程股份有限公司）。正置熒光顯微鏡（日本尼康，Nikon ECLIPSE C1）、成像系統(tǒng)（日本尼康，Nikon DS-U3）、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司，ChemiScope 610）、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)賽洛捷克，SCILOGEX D3024）、高速低溫組織研磨儀（武漢賽維爾生物，KZ-III-F）、全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)（上海宏石醫(yī)療科技有限公司，SLAN-96S）、電泳儀（美國(guó) Bio-Rad Laboratories, PowerPac Basic）、光譜儀（美國(guó)伯滕 Bio Tek,μ Quant）等。
（六）動(dòng)物造模及干預(yù)方法
根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》計(jì)算大鼠等效劑量，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道和前期研究基礎(chǔ)，35只Wistar大鼠以鹽酸洛哌丁胺（1.5 mg/kg）灌胃，1天2次建立便秘模型，干預(yù)時(shí)間為9:00和18:00。通過(guò)一般情況、排便情況、糞便性狀、糞便含水量、首粒黑便時(shí)間驗(yàn)證造模成功。造模過(guò)程中無(wú)死亡，造模成功31只，成功率88.6%。選取30只用于后續(xù)試驗(yàn)。
將所有Wistar大鼠適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)7天后采集基線數(shù)據(jù)，選取造模成功的Wistar大鼠30只隨機(jī)分為模型組、橙皮苷低劑量組、橙皮苷中劑量組、橙皮苷高劑量組、聚乙二醇4000散干預(yù)組（簡(jiǎn)稱西藥組），每組6只，單獨(dú)飼養(yǎng)于代謝籠中。另設(shè)空白組6只予以造模藥等量的生理鹽水灌胃14天，在最后7天同時(shí)予以干預(yù)藥等量的生理鹽水灌胃。模型組予以洛哌丁胺溶液灌胃14天，在最后7天同時(shí)予以干預(yù)藥等量的生理鹽水灌胃。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，設(shè)置橙皮苷低、中、高劑量組予以洛哌丁胺溶液灌胃14天，在最后7天同時(shí)予以橙皮苷混懸液［低劑量組：50 mg/（kg·d）；中劑量組：100 mg/（kg·d）；高劑量組200 mg/ （kg ·d），分別相當(dāng)于成人用量的1、2、4倍］灌胃，干預(yù)時(shí)間為13:30。西藥組予以洛哌丁胺溶液灌胃14天，在最后7天同時(shí)予以聚乙二醇4000散［0.9g/（kg·d）]灌胃，干預(yù)時(shí)間為13:30。
末次給藥后6h（24:00）左右集體處死大鼠，頸椎脫臼處死大鼠后迅速剖腹，截取所需位置及質(zhì)量的結(jié)腸腸段組織，PBS緩沖液輕柔洗凈后，立即置于液氮罐內(nèi)，-80℃冰箱保存組織。
（七）檢測(cè)指標(biāo)及方法
1、一般情況
實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察并記錄各組大鼠的一般情況，記錄每天實(shí)驗(yàn)前后的體重、進(jìn)食量、排便情況等。
2、首粒黑便時(shí)間
于第1天和第14天清晨（7:00），均給予大鼠10 mL/kg 的墨汁灌胃，記錄準(zhǔn)確灌胃時(shí)間及首粒黑便排出時(shí)間，得出間隔時(shí)間。
3、糞便含水量的檢測(cè)
及時(shí)收集第1天和第14 天實(shí)驗(yàn)前（0:00～7:00）所有糞便排泄物，將糞便（含離心管）稱重（濕重）后置于37 ℃溫箱中干燥5天，稱干燥后糞便（含離心管）重量（干重），按以下公式計(jì)算糞便含水量。糞便含水量（%）=（濕重﹣干重）/（濕重﹣離心管重）x100%。
4、ELISA檢測(cè)結(jié)腸組織中5﹣羥色胺（5-HT）及5﹣羥色胺4型受體（5-HT4R）含量
截取100mg結(jié)腸組織，剪成小塊放入組織研磨器中，加入1mL PBS，制成勻漿，置于﹣20℃冰箱過(guò)夜。經(jīng)反復(fù)凍融2次破壞細(xì)胞膜后，將組織勻漿以2～8℃，5000xg，離心5 min，取上清。取適量上清液立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，避免反復(fù)凍融。操作步驟嚴(yán)格按照5-HT、5-HT4R EIA kit 試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。
5、HE染色
結(jié)腸組織樣本經(jīng)4％多聚甲醛固定，固定狀態(tài)良好后，嚴(yán)格按照病理實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SOP程序進(jìn)行修剪、脫水、包埋、切片、染色、封片最后鏡檢合格的樣片，厚度3μm。從3個(gè)橙皮苷干預(yù)組中選取便秘表型改善最為明顯的1個(gè)組大鼠結(jié)腸組織進(jìn)行檢測(cè)及比較，下同。
6、Western Blot 檢測(cè)結(jié)腸組織中PDGFRαP2Y1、c-kit、SK3、ANO1蛋白水平
截取的Wistar大鼠結(jié)腸組織放入RIPA裂解液中于冰上裂解10min，裂解完成后以12000xg離心力離心10 min，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。配置濃縮膠和12％分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳。在S1模式電壓80V和S2模式120V電壓下分離，200mA將凝膠上的蛋白濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5％脫脂奶粉封閉液室溫?fù)u床封閉1h，加入一抗4℃孵育過(guò)夜PDGFRα （1:1 000 ），KCNN3 （1: 1 000）, ANO1 （1:1 000 ）, P2Y12（1:1 000 ）, c-kit（1:1 000）。TBST 漂洗后加入二抗（HRP標(biāo)記山羊抗兔lgG）（1:10 000），室溫孵育1 h，再次TBST漂洗。PVDF 膜的蛋白面朝上放在樣本托盤(pán)上，ECL（BL520B）與此混合液充分接觸，在圖像采集軟件下采集圖像，使用勤翔化學(xué)分析軟件進(jìn)行灰度分析。
7、qRT-PCR檢測(cè)結(jié)腸組織中PDGFRα、P2Y1、c-kit、SK3、ANO1的mRNA水平
截取距盲腸2cm新鮮近端結(jié)腸組織150mg，采用Tripure一步法提取細(xì)胞RNA，取2μLRNA加入98μL DEPC﹣水中，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA樣品在260nm和280nm處的OD值，以在1.8～2.0之間為合格。以RNA為模版反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按總體積20μL（順序：上游引物1.0 μL、下游引物1.0μL、FastStart Universal SYBR Green Master 10.0 μL、cDNA模版5.0 μL、H2O 3.0 μL）加待測(cè)樣品基因反應(yīng)體系；反應(yīng)條件為：95℃ 10 min，循環(huán)1次；95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72℃ 30s，循環(huán)40次；最后加熔解曲線（95℃ 15s、60℃ 15s，逐漸升至95℃超過(guò)30 min）。在PCR儀上反應(yīng)，每份樣品3個(gè)復(fù)孔測(cè)定，設(shè)陰性、空白對(duì)照。通過(guò)分析軟件得到樣品閾值循環(huán)數(shù)（CT）和相對(duì)的拷貝定量，再進(jìn)行樣本之間的比較。采用2ΔΔct方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，△ Ct＝目的基因Ct﹣內(nèi)參基因Ct；△ △ Ct＝干預(yù)組△ Ct﹣空白組△ Ct；相差倍數(shù)＝2ΔΔct，對(duì)照組的數(shù)值設(shè)為100%。
8、免疫熒光（雙重染色）檢測(cè)結(jié)腸組織中ANO1-PDGFRα和 PDGFRα-PGP9.5 的表達(dá)
分別脫蠟至水：依次將石蠟切片放入二甲苯I15 min﹣二甲苯II 15 min﹣無(wú)水乙醇I 5 min﹣無(wú)水乙醇II 5 min-85％酒精5 min-75％酒精5 min﹣蒸餾水洗?？乖迯?fù)：置于盛滿 EDTA抗原修復(fù)緩沖液（pH8.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)。中火8 min?；? min轉(zhuǎn)中低火7 min，此過(guò)程中應(yīng)防止緩沖液過(guò)度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS（pH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5 min。畫(huà)圈自發(fā)熒光淬滅：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫(huà)圈（防止抗體流走），在圈內(nèi)加入自發(fā)熒光淬滅劑5 min，流水沖洗10 min。血清封閉：在圈內(nèi)滴加BSA孵育30 min。加一抗（PDGFRα）后將切片平放于濕盒內(nèi)4℃孵育過(guò)夜。加二抗（ANO1或蛋白基因產(chǎn)物9.5/PGP9.5）：玻片置于PBS中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50 min。DAPI復(fù)染細(xì)胞核：玻片置于PBS中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10 min。封片：玻片置于PBS中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像（DAPI紫外激發(fā)波長(zhǎng)330～380nm，發(fā)射波長(zhǎng)420nm，發(fā)藍(lán)光；FITC激發(fā)波長(zhǎng)465～495nm，發(fā)射波長(zhǎng)515～555 nm，發(fā)綠光；CY3激發(fā)波長(zhǎng)510～560,發(fā)射波長(zhǎng)590nm，發(fā)紅光）。
（八）統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用SPSS 28.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，數(shù)據(jù)以x（均值）±s表示。滿足正態(tài)性和方差齊性的多組之間均數(shù)比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD法，方差不齊者采用Dunnett's T3檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)結(jié)果用GraphPad prism8.0制作圖形。
二、結(jié)果
（一）一般情況
造模前各組大鼠均活潑好動(dòng)，皮毛光澤度好，糞便呈連續(xù)條狀，質(zhì)軟且表面水分較多。第3～7天，模型組和各干預(yù)組均出現(xiàn)活動(dòng)量減少，皮毛光澤度變黯淡，糞粒干硬、粒形縮短，排便量下降，模型組上述表現(xiàn)持續(xù)至第14天，而各干預(yù)組第9～10天后癥狀逐漸改善，尤其橙皮苷中、高劑量干預(yù)組和西藥組第 13～14天糞粒性狀與空白組相近。
（二）各組體重和進(jìn)食量比較
與本組干預(yù)第1天比較，各組第14天大鼠的體重均有增長(zhǎng)（P<0.01），組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；各組大鼠進(jìn)食量干預(yù)前后及組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
（三）各組糞便含水量和首粒黑便時(shí)間比較
與空白組同期比較，第14天模型組糞便含水量降低（P<0.05），首粒黑便時(shí)間延長(zhǎng)（P<0.01）；與模型組同期比較，干預(yù)第14天橙皮苷中、高劑量組和西藥組的糞便含水量增加（P<0.05，P<0.01），首粒黑便時(shí)間縮短（P<0.05,P<0.01）；第14天各干預(yù)組組間兩兩比較，橙皮苷高劑量組的糞便含水量高于低劑量組，首粒黑便時(shí)間短于低劑量組（P<0.05），余差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
（四）各組結(jié)腸組織5-HT和5-HT4R含量比較
與空白組比較，模型組結(jié)腸5-HT和5-HT4R含量均降低（P<0.05）；與模型組比較，橙皮苷中、高劑量組結(jié)腸5-HT 和 5-HT4R含量均升高（P<0.05，P<0.01）；各干預(yù)組組間兩兩比較，橙皮苷高劑量組結(jié)腸5-HT和5-HT4R 含量均高于低劑量組和西藥組（P<0.05），橙皮苷中劑量組結(jié)腸5-HT4R含量高于西藥組（P<0.05），余差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
（五）各組結(jié)腸病理結(jié)果比較
橙皮苷高劑量組的療效最為顯著，故選擇空白組、模型組和橙皮苷高劑量組的結(jié)腸組織進(jìn)行檢測(cè)及比較。空白組和橙皮苷高劑量組：結(jié)腸各層結(jié)構(gòu)清晰緊密，黏膜上皮完整，腸腺豐富，排列整齊，腸腺上皮中杯狀細(xì)胞清晰可見(jiàn)，未見(jiàn)明顯其他異常。模型組大鼠結(jié)腸黏膜層上皮壞死脫落，腸腺局灶性壞死，黏膜肌層肌纖維腫脹變厚；黏膜下層重度水腫，結(jié)締組織疏松，其內(nèi)淋巴管擴(kuò)張，管腔內(nèi)大量淋巴細(xì)胞，肌層變薄。
（六）3組結(jié)腸組織SIP合胞體標(biāo)記蛋白表達(dá)水平比較
與空白組比較，模型組結(jié)腸PDGFRα、P2Y1、c-kit、SK3、ANO 平均降低（P<0.01）；與模型組比較，橙皮苷高劑量組結(jié)腸PDGFRα、P2Y1、c-kit、SK3、ANO1蛋白表達(dá)水平均升高（P<0.01）。
（七）3組結(jié)腸組織SIP合胞體標(biāo)記蛋白mRNA表達(dá)水平比較
與空白組比較，模型組結(jié)腸PDGFRα、P2Y1、c-kit、SK3、ANO1mRNA水平均降低（P<0.01）；與模型組比較，橙皮苷高劑量組結(jié)腸PDGFRα、P2Y1、c-kit、SK3、ANO1 mRNA水平均升高（P<0.01）。
（八）3組大鼠免疫熒光結(jié)果比較
空白組大鼠結(jié)腸中PDGFRa 陽(yáng)性（紅光）和ANO1陽(yáng)性（綠光）主要共表達(dá)在肌間和肌層，二者似呈伴行、毗鄰的關(guān)系，而在黏膜、黏膜下層僅有少量表達(dá)。橙皮苷高劑量組與空白組相似，且PDGFRα與ANO1共表達(dá)更為明顯。相較于空白組和橘皮苷高劑量組，模型組陽(yáng)性染色明顯減少，在結(jié)腸肌間和肌層有少量表達(dá)。
空白組大鼠結(jié)腸中PDGFR& 陽(yáng)性（紅光）和PGP9.5 陽(yáng)性（綠光）主要共表達(dá)在肌間和肌層，且呈伴行、毗鄰的關(guān)系，而在黏膜、黏膜下層亦有少量表達(dá)，橙皮苷高劑量組與空白組相似。相較于空白組和橙皮苷高劑量組，模型組陽(yáng)性染色明顯減少，在結(jié)腸肌間和肌層僅有少量表達(dá)。
三、討論
中醫(yī)藥在便秘的治療中占據(jù)重要地位，許多中藥及中藥復(fù)方均具有導(dǎo)瀉通便或調(diào)節(jié)腸道功能等作用。枳實(shí)是達(dá)立通顆粒的君藥，橙皮苷是枳實(shí)中含量最高的活性成分，能有效激活H1阻胺受體，具有顯著的促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)作用。
洛脈丁胺灌胃是目前行之有效的功能性便秘造模方式之。據(jù)報(bào)道，洛哌丁胺可導(dǎo)致結(jié)腸肌層變薄、杯狀細(xì)減少，腸絨毛及黏膜上皮壞死脫落，絨毛排列松散，分腺體結(jié)構(gòu)消失，固有層炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。在相關(guān)研究中，洛哌丁胺造模導(dǎo)致的病理改變與之前報(bào)道相吻合，且大鼠腸道傳輸減慢，符合功能性便秘表型。研究表明，功能性便秘模型大鼠的結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)及形態(tài)發(fā)生明顯改變，但橙皮苷干預(yù)后黏膜上皮的壞死脫落及炎癥侵潤(rùn)現(xiàn)象得到明顯改善，腸道傳輸明顯加快。大鼠的便秘癥狀得到明顯好轉(zhuǎn)，證實(shí)了橙皮苷對(duì)大鼠功能性便秘確有療效。
SIP合胞體對(duì)于胃腸動(dòng)力調(diào)節(jié)具有重要意義。盡管橙皮苷治療功能性便秘的效果與聚乙二醇4000散類似，但二者的作用機(jī)制并不相同。5-HT作為一種重要的腸神經(jīng)遞質(zhì)，其信號(hào)系統(tǒng)廣泛參與調(diào)節(jié)胃腸道的運(yùn)動(dòng)、蠕動(dòng)、分泌和感覺(jué)。5-HT受體脫敏及信號(hào)減弱與功能性便秘發(fā)病有關(guān)。多項(xiàng)研究提示橙皮苷可通過(guò)增5-HT信號(hào)促進(jìn)腸動(dòng)力。與之相吻合的是，橙皮苷干預(yù)顯著上調(diào)了功能性便秘大鼠結(jié)腸組織中5-HT和5-HT4R的表達(dá)。提示橙皮苷可激活5-HT信號(hào)，改善SIP合胞體功能促進(jìn)腸動(dòng)力進(jìn)而治療便秘，但其分子機(jī)制和信號(hào)通路仍需進(jìn)一步研究。而聚乙二醇4000散對(duì)5-HT信號(hào)無(wú)明顯作用，其主要是通過(guò)內(nèi)滲透壓改善便秘。
據(jù)報(bào)道，結(jié)腸存在多種ICC亞型，其中肌間型和黏膜下層型為構(gòu)成SIP合胞體的主要亞型。通常，腸運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的神經(jīng)末梢含多種神經(jīng)遞質(zhì)，釋放后擴(kuò)散到鄰近SIP合胞體發(fā)揮效應(yīng)。興奮性遞質(zhì)如乙酰膽堿（Ach）、P物質(zhì)（SP），結(jié)合ICC上特定受體（如M3、NK1）后，增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放，激活ANO1，引起ICC去極化而導(dǎo)致SMC收縮。相反，抑制性遞質(zhì)如一氧化氮（NO）、β-NAD，可結(jié)合PDGFRα＋細(xì)胞上特定受體（如sGC、P2Y1）后引起超極化，導(dǎo)致SMC舒張。小鼠結(jié)腸中PDGFRα+細(xì)胞及SMC過(guò)度超極化可引起結(jié)腸慢傳輸。SMC的收縮與舒張直接影響著 SW的強(qiáng)度。有研究證實(shí)慢傳輸型功能性便秘患者結(jié)腸ICC細(xì)胞數(shù)量明顯減少，其保留的SW無(wú)法與推進(jìn)性運(yùn)動(dòng)同步及協(xié)調(diào)。因此ICC與PDGFRα＋細(xì)胞的表型維持對(duì)逆轉(zhuǎn)功能性便秘至關(guān)重要。
PGP 9.5是一種反映神經(jīng)元密度的泛神經(jīng)元標(biāo)志物，在黏膜下和肌間神經(jīng)叢中均有表達(dá)。在本研究中，ANO1被用于標(biāo)記ICC，PDGFRα被用于標(biāo)記PDGFRα＋細(xì)胞，其熒光強(qiáng)度顯示二者在結(jié)腸中的分布。結(jié)果顯示，便秘大鼠結(jié)腸中PGP9.5陽(yáng)性染色明顯減少，ANO1、PGP9.5均與PDGFRα呈現(xiàn)共表達(dá)、伴行、毗鄰的分布特點(diǎn)。提示ICC和PDGFRα＋細(xì)胞與ENS的腸內(nèi)神經(jīng)伴行和毗鄰，SIP合胞體受ENS神經(jīng)﹣內(nèi)分泌信號(hào)調(diào)控，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。然而，橙皮苷高劑量顯著上調(diào)了ICC 和PDGFRα ＋細(xì)胞的表達(dá)，為功能性便秘治療提供了細(xì)胞物質(zhì)基礎(chǔ)。
ICC特異性高表達(dá)c-kit信號(hào)對(duì)于ICC表型維持至關(guān)重要，嚴(yán)重影響SMC起搏及傳導(dǎo)功能。ANO1激活后引起自發(fā)性瞬時(shí)去極化，產(chǎn)生SW，激活SMC上的L﹣型鈣通道而引發(fā)平滑肌收縮。PDGFRα＋細(xì)胞特異性嘌呤類遞質(zhì)P2Y1受體和小電導(dǎo)鈣激活鉀通道3（SK3）激活后的效應(yīng)與ANO1相反。二者互作共同維持SW強(qiáng)度。因此，ANO1、PDGFRα、c-kit、P2Y1、SK3表達(dá)水平低反映ICC和PDGFRα＋細(xì)胞數(shù)量減少，SIP合胞體活性下降與結(jié)腸動(dòng)力障礙。然而，橙皮苷干預(yù)顯著逆轉(zhuǎn)了功能性便秘大鼠結(jié)腸組織中標(biāo)志物蛋白（PDGFRα、ANO1）和功能蛋白（P2Y1、c-kit、SK3、ANO1）的下調(diào)。反映了橙皮苷促進(jìn)了SIP合胞體表型及功能，腸動(dòng)力的恢復(fù)。綜上，研究提示橙皮苷可通過(guò)可激活結(jié)腸5-HT信號(hào)，上調(diào)ANO1、c-kit、PDGFRα 、P2Y1 和SK3 的表達(dá)水平，恢復(fù)ICC和PDGFRα＋細(xì)胞的表型及功能，改善SIP合胞體功能及結(jié)腸動(dòng)力，從而對(duì)洛哌丁胺誘導(dǎo)的便秘大鼠起到干預(yù)作用。為功能性便秘、功能性消化不良、功能性便秘伴功能性消化不良乃至功能性腸病的治療提供新思路。
文獻(xiàn)資料
1、中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)脾胃病分會(huì)，功能性消化不良中醫(yī)診療專家共識(shí)意見(jiàn)（2023），中華中醫(yī)藥學(xué)雜志，2024，39（3）：1372～1378
2、唐偉峰等，功能性便秘的中西醫(yī)研究進(jìn)展，世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2015，10（6）：880～884
3、任曉峰等，功能性便秘患者結(jié)腸傳輸試驗(yàn)結(jié)果及肛直腸測(cè)壓參數(shù)的關(guān)系，廣西醫(yī)學(xué)，2021，43（14）：1664～1668
4、侯葉廷等，功能性消化不良與功能性便秘胃排空情況及其相互關(guān)系的研究，現(xiàn)代消化及介入診療，2012，17（4）：205～207
5、劉思純，功能性胃病，新醫(yī)學(xué)，2000，11（11）：649
6、蘇艷等，達(dá)立通顆粒主要活性成分在正常及功能性消化不良模型大鼠胃腸道組織中差異分布研究，藥物評(píng)價(jià)研究，2024，47（5）：1017～1029
7、占煜等，橙皮苷改善洛哌丁胺誘導(dǎo)便秘大鼠結(jié)腸SIP合胞體功能的研究，中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2023，45（1）：67～75
本文僅供專業(yè)人士參考。
本文綜合整理自南昌弘益藥物研發(fā)團(tuán)隊(duì)，歡迎轉(zhuǎn)發(fā)，禁止轉(zhuǎn)載，轉(zhuǎn)載授權(quán)請(qǐng)聯(lián)系0791-88161315。
